Die Serie handelt von vier mutierten Schildkröten, die in der Kanalisation New Yorks leben. Die vier Turtles werden von dem zu einer Ratte mutierten Hamato Yoshi, der sich nun Splinter nennt, in der fernöstlichen Kampfkunst Ninjutsu unterrichtet. Splinter spielt dabei eine Art Vaterfigur. Den einzigen unverdeckten Kontakt zur Oberfläche halten die fünf mit einer Fernsehreporterin namens April O’Neil, später auch mit deren Kollegin Irma und einem Mann namens Casey Jones. Die vier Schildkröten ernähren sich vorzugsweise von Pizza. Jede der vier Hauptfiguren besitzt einen bestimmten Charakterzug. So ist Leonardo der Anführer, Donatello der Denker, Raphael der Draufgänger und Michelangelo der Komiker. Die Turtles unterscheiden sich weiter durch die Farbe der Stirnbänder (in den Original-Comics trugen allerdings alle Turtles rote Stirnbänder), den grünen Ton ihrer Hautfarben und ihre Waffen. Leonardo trägt ein blaues Stirnband und kämpft mit zwei Katana, Donatello trägt Lila und verteidigt sich mit einem Bō (Schlagstock), Raphael zeichnet sich durch sein rotes Stirnband und seine Sai aus, Michelangelo trägt Orange und benutzt Nunchaku. Allen gemeinsam ist ihr charakteristischer Schlachtruf „Cowabunga!“. Die Gegenspieler der Turtles sind Oroku Saki, ein ehemaliger Schüler Yoshis, der sich jetzt Shredder nennt, und Krang, ein Außerirdischer aus der Dimension X. Unterstützt werden die beiden vom Foot-Clan, Roboter-Versionen des Ninja-Clans, aus dem Yoshi und Saki stammen, sowie von Bebop und Rocksteady, zwei Straßenschlägern, die Shredder in ein Nashorn (Rocksteady) und ein Warzenschwein (Bebop) mutiert hat. Immer wieder tauchen auch andere, meist ebenfalls mutierte, Gegenspieler auf.