Gunslinger Girl spielt im modernen Italien und folgt einer Gruppe traumatisch verletzter junger Mädchen aus Krankenhäusern im ganzen Land, die von einer geheimen Zweigstelle der Public Corporation for Social Welfare, Abschnitt 2, kybernetisch verbessert, indoktriniert und zu Attentätern ausgebildet werden Jedes Mädchen ist einem männlichen Betreuer zugeordnet, der die Ausbildung, den Einsatz und das allgemeine Verhalten überwacht. Jeder Handler kann seinen kybernetischen Attentäter so weit "konditionieren", wie er es für richtig hält, was die Tödlichkeit und Loyalität eines Mädchens auf Kosten der menschlichen Individualität und Lebensspanne erhöht.